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PCR技術(shù)服務(wù)-PCR的實(shí)用技巧

更新時(shí)間:2016-07-08      瀏覽次數(shù):1640

上海信帆生物代做PCR實(shí)驗(yàn),歡迎大家!

增加PCR的特異性:
1. primers design
這是zui重要的一步。理想的,只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些條件
1) 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說越長越好,太長的primer同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量
2) GC% 40%~60%
3) 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
4) 避免3'端GC rich, zui后3個(gè)BASE不要有GC,或者zui后5個(gè)有3個(gè)不要是GC (有人說:3' 端是 GC/CG/CC/GG。)
5) 避免3'端的互補(bǔ), 否則容易造成DIMER
6) 避免3'端的錯(cuò)配
7) 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)
8) 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時(shí)不算,但在檢測互補(bǔ)和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們
9) 使用兼并primer時(shí), 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用 較高的primer濃度(1uM-3uM)
10) 學(xué)會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al.
* primer的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度(Tm)。這是當(dāng)50%的primer和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證primer同目的序列有效退火, 同時(shí)還要足夠高,以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比primer的 Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交,適用于小于18堿基的primer。
有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定primerTmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和 相鄰堿基的特性預(yù)測primer的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算器程序使用近鄰分析法。
根據(jù)所使用的公式及primer序列的不同,Tm會差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值,所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)??梢酝ㄟ^分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃,以2℃為增量,逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少primer二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得*結(jié)果,兩個(gè)primer應(yīng)具有近似的Tm值。primer對的Tm差異如果超過5℃,就會primer在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)primerTm不同,將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃
或者為了提高特異性,可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度*行5個(gè)循環(huán),然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2. stability of primers
定制primer的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。
primer產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制primer以干粉形式運(yùn)輸。在TE重溶primer,使其zui終濃度為100μM。TE比去離子水好,因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸,會引起寡核甘的水解。 primer的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的primer儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的primer在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月,但在室溫(15℃到30℃)僅能保存不到1周。干粉primer可以在-20℃保存至少1年,在室溫(15℃到30℃)zui多可以保存2個(gè)月。

上海信帆生物公司主要代理產(chǎn)品:
ELISA試劑盒:進(jìn)口ELISA試劑盒,國產(chǎn)ELISA試劑盒,人elisa試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒等。
培養(yǎng)基:微生物培養(yǎng)基,顯色培養(yǎng)基,BD培養(yǎng)基,gibco培養(yǎng)基等。
血清:胎牛血清,科研血清,動物血清,NQBB,Hyclone,Gbico原裝血清 。
生物試劑:Amresco,Sigma,ABM,BIO-RAD,BD,ABCAM等進(jìn)口試劑。
標(biāo)準(zhǔn)品對照品:進(jìn)口對照品,進(jìn)口對照藥材,進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品.
抗體:一抗,二抗,流式抗體等。
放免試劑盒:進(jìn)口放免試劑盒,國產(chǎn)放免試劑盒,進(jìn)口美國鳳凰等放免試劑盒。
實(shí)驗(yàn)室代測服務(wù):放免代測,WB實(shí)驗(yàn),免疫組化代測,熒光定量PCR代測,病理細(xì)胞染色代測,生化實(shí)驗(yàn)代測等。

 

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