細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室里zui常見(jiàn)和zui基本的實(shí)驗(yàn)了，但卻不是zui簡(jiǎn)單的。別小看細(xì)胞培養(yǎng)，這里可蘊(yùn)含著大學(xué)問(wèn)。有時(shí)候細(xì)胞狀態(tài)不好，轉(zhuǎn)染、藥篩這些實(shí)驗(yàn)根本就沒(méi)辦法做。影響細(xì)胞培養(yǎng)的因素很多，讓我們先從培養(yǎng)基和血清說(shuō)起。

經(jīng)典的培養(yǎng)基有很多種，Invitrogen(GIBCO)、thermo fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是應(yīng)用zui廣泛的培養(yǎng)基。其他如M199、IMDM、L15培養(yǎng)基等也用于某些細(xì)胞的培養(yǎng)。

◆ MEM是由Eagle’s基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BME)發(fā)展而來(lái)的，其中增加了組分的范圍及濃度。

◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培養(yǎng)基是為小鼠成纖維細(xì)胞設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在常用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩倍，維生素濃度是MEM的4倍，采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩沖作用。zui初的配方中葡萄糖含量為1000 mg/L，后來(lái)為了某些細(xì)胞的生長(zhǎng)需要，將葡萄糖含量又調(diào)整為4500 mg/L，這就是大家常說(shuō)的低糖和高糖了。

◆ aMEM含有附加的氨基酸、維生素以及核苷和脂肪酸，它可廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞類型，包括對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分要求苛刻的細(xì)胞。

◆ Ham’s F12是為在低血清濃度下克隆CHO細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于克隆形成率的分析及原代培養(yǎng)。F12還可以與DMEM等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結(jié)合的產(chǎn)物，這種培養(yǎng)基已應(yīng)用于許多原代培養(yǎng)及更難養(yǎng)的細(xì)胞系的培養(yǎng)。

◆ RPMI 1640培養(yǎng)基是專為淋巴細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。

以前經(jīng)常聽(tīng)到有人問(wèn)，這種細(xì)胞該用哪一種培養(yǎng)基呢?其實(shí)這個(gè)問(wèn)題的答案可以很簡(jiǎn)單，也可以好復(fù)雜。此話怎講?如果這種細(xì)胞是購(gòu)自ATCC或其他的細(xì)胞庫(kù)，那很簡(jiǎn)單，問(wèn)供應(yīng)商就行了。或者找到相關(guān)的文獻(xiàn)，作為參考。Invitrogen上有一個(gè)Cell Line Database的工具，也很好用。選擇你感興趣的細(xì)胞類型，它就會(huì)彈出推薦的培養(yǎng)基、血清和轉(zhuǎn)染試劑等，有時(shí)還有優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染步驟，很方便。Sigma上也有一個(gè)Media Expert，包括了培養(yǎng)基所有成分的功能描述、使用推介和參考文獻(xiàn)等，它還是一個(gè)解決問(wèn)題能手，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)中的常見(jiàn)問(wèn)題，如細(xì)胞貼壁不好、培養(yǎng)基變色等，它都會(huì)列出可能的原因，并提供補(bǔ)救辦法。這個(gè)Expert果然不簡(jiǎn)單!

但如果你是著手建立一種全新細(xì)胞的培養(yǎng)體系，根本找不到任何參考，那你就得花點(diǎn)時(shí)間自己試驗(yàn)了。萬(wàn)事開(kāi)頭難嘛。因?yàn)闆](méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)答案。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)?？傊?，MEM做貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI 1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)是一個(gè)好的開(kāi)始。你也可以購(gòu)買幾種培養(yǎng)基來(lái)，然后花大約兩周的時(shí)間做一個(gè)簡(jiǎn)單的細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，來(lái)選擇其中的。有時(shí)候你會(huì)驚訝地發(fā)現(xiàn)你的*培養(yǎng)條件與文獻(xiàn)報(bào)道的不同，就算是同一種培養(yǎng)條件，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也時(shí)好時(shí)壞，這是很正常的。因?yàn)樵噭⑺?、不同批?hào)的血清之間都存在著差異。要提高培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，可以從培養(yǎng)基和血清兩方面入手。

以前大部分實(shí)驗(yàn)室都是用干粉培養(yǎng)基，但配制過(guò)程就較為繁瑣，要溶解、調(diào)pH值，過(guò)濾，過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一些濃度誤差，而且有些實(shí)驗(yàn)室的水質(zhì)并不理想，所以培養(yǎng)的效果會(huì)有差異。如果使用液體培養(yǎng)基，這種人為的誤差會(huì)減少，因?yàn)楫吘故谴笈抗I(yè)化生物試劑的，批間差會(huì)很小。大家是不是感覺(jué)液體培養(yǎng)基會(huì)貴很多，以前是這樣，但現(xiàn)在非也。HyClone和Invitrogen都在國(guó)內(nèi)建立了液體培養(yǎng)基的生物試劑基地，生物試劑和運(yùn)輸成本大幅降低，所以現(xiàn)在的價(jià)格也只是50-60元/500ml，比干粉培養(yǎng)基貴不了多少，而且還幫你省了過(guò)濾器和時(shí)間。

血清含有生長(zhǎng)因子可促進(jìn)細(xì)胞的繁殖，含有附著因子可促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，同時(shí)還具有抗胰酶活性。血清同時(shí)也是礦物質(zhì)、脂類及激素的來(lái)源。zui常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時(shí)間的早晚來(lái)分類的。采血時(shí)間越早，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越豐富，所含抗體也越少，因而胎牛血清適合要求高的細(xì)胞系和克隆化培養(yǎng)。由于瘋牛病的原因，到目前為止，我國(guó)政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等地區(qū)進(jìn)口牛血清，因此市面上的牛血清大多來(lái)自澳洲、南美洲，或是國(guó)產(chǎn)的。

而血清批次間的差別就是不可避免的，這種差異來(lái)源于不同的制備方法和除菌方法、動(dòng)物的年齡差別及血清的儲(chǔ)存條件等，而且與取血?jiǎng)游锏膩?lái)源關(guān)系密切。不同的牧場(chǎng)、不同的氣候天氣及其他環(huán)境因素都可能影響血清的質(zhì)量。因此選好了一種血清就要盡可能長(zhǎng)期使用它。在需要更換時(shí)，也要盡量保持與原有的一批血清相似?，F(xiàn)在很多公司都提供血清預(yù)留，你一旦選定了某個(gè)批次的血清，備足一年的量，這樣可以避免很多麻煩。

血清固然是細(xì)胞培養(yǎng)中*的成分，但正如上文所說(shuō)，血清的批間差異大，更換血清時(shí)需要做大量的測(cè)試以取保替換的血清與原來(lái)的相似。而血清的供應(yīng)也是必須要考慮的因素。由于氣候或瘋牛病的影響，說(shuō)不定哪天血清就突然沒(méi)得賣了，那對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響可非同小可。另外，血清的價(jià)格也很昂貴，雖說(shuō)現(xiàn)在也有便宜的國(guó)產(chǎn)血清，但是高品質(zhì)的澳洲血清價(jià)格仍舊高企。因此，也有一些實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始換用無(wú)血清培養(yǎng)基。

無(wú)血清培養(yǎng)基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顧名思義，就是在細(xì)胞培養(yǎng)中不需要添加血清，但是在某些應(yīng)用中可能要添加生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子。無(wú)血清培養(yǎng)基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長(zhǎng)因子、必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素等，能減少上述血清帶來(lái)的不利因素，使細(xì)胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定。但它也不是的，從有血清培養(yǎng)過(guò)渡到無(wú)血清培養(yǎng)的條件并不像想象中那么直截了當(dāng)。處于發(fā)育的不同分化階段的細(xì)胞(例如干細(xì)胞與定向前體細(xì)胞相比)需要不同的配方，對(duì)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的選擇尤為重要。而且在去除血清的同時(shí)，也去除了一些血清蛋白具有的保護(hù)、解毒作用，因此對(duì)試劑、水的純度和儀器清潔度的要求更高。另外，它的價(jià)格也比普通的培養(yǎng)基貴很多。

現(xiàn)在有很多廠家生物試劑無(wú)血清培養(yǎng)基。GIBCO這個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的金字招牌當(dāng)然少不了，它也是zui早研制無(wú)血清培養(yǎng)基的。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了ES細(xì)胞、雜交瘤、CHO、293、昆蟲(chóng)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。上個(gè)月還推出了*間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，能使MSC維持未分化狀態(tài)超過(guò)9代。HyClone公司也有CHO、293、雜交瘤細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、病毒疫苗細(xì)胞的多種無(wú)血清培養(yǎng)基。Sigma則剛剛收購(gòu)了澳大利亞JRH公司，有了JRH的EX-CELL系列，無(wú)血清培養(yǎng)基的選擇也更多了。

這么多種，要選擇起來(lái)也是個(gè)頭疼的事情。除了部分培養(yǎng)基是公開(kāi)配方的，如用于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的MCDB 131(Sigma)，大部分液體培養(yǎng)基都是配方的，也就是說(shuō)其中的成分是保密的。那么你只能是檢索文獻(xiàn)、讓供應(yīng)商推薦，然后用自己的細(xì)胞做幾次傳代培養(yǎng)來(lái)選出zui合適的培養(yǎng)基。畢竟實(shí)踐出真知嘛。

P.S.附上一些細(xì)胞培養(yǎng)中的小Tip，可能會(huì)對(duì)您有所啟發(fā)。(部分摘自Invitrogen的中文Focus)

• 切記，細(xì)胞培養(yǎng)基的儲(chǔ)存條件是2-8攝氏度。如果細(xì)胞培養(yǎng)基不小心被凍，您應(yīng)該融化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

• 貯存在冰箱中的瓶口已開(kāi)的培養(yǎng)基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時(shí)，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開(kāi)瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來(lái)校正溶液的pH值(確定松開(kāi)瓶口以保證氣體交換)。

• 當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

• 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。

• 總之，大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。

• 血清的熱滅活在免疫分析時(shí)可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往*的操作步驟，并沒(méi)有確鑿的證據(jù)說(shuō)明這樣做是有益的。相反，對(duì)大部分細(xì)胞而言，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因?yàn)榧訜峥赡苁寡逯械某恋碓黾?，使您誤以為污染。

• 如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?

1. 解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。并隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

2. 請(qǐng)勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

3. 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。

4. 若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。

• 在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，我們強(qiáng)烈推薦進(jìn)行臺(tái)盼蘭活性記數(shù)。研究者常常通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的稀釋(1∶4或1∶2)進(jìn)行傳代，不進(jìn)行活性檢測(cè)，您可能接種比你認(rèn)為的低的多的濃度的細(xì)胞，這常常可能導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢或培養(yǎng)物根本不生長(zhǎng)。

• 貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能開(kāi)始降解，如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。

• 在訂購(gòu)的細(xì)胞到達(dá)后，應(yīng)立即復(fù)蘇，如果培養(yǎng)基還沒(méi)有準(zhǔn)備好，可將其放入液氮中，盡快復(fù)蘇。千萬(wàn)不能放置在-20或-80℃的冰箱內(nèi)。

• 細(xì)胞復(fù)蘇往往是比較容易出問(wèn)題的步驟。請(qǐng)?jiān)谟嗁?gòu)細(xì)胞時(shí)就向供應(yīng)商索取詳細(xì)的復(fù)蘇步驟，并仔細(xì)閱讀。有些供應(yīng)商就不推薦在復(fù)蘇時(shí)離心，對(duì)此類細(xì)節(jié)，應(yīng)特別留意。

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