PRODUCT CLASSIFICATION
產品分類ELISA實驗中細胞樣本的收集和處理方法
細胞上清
需保證各組間培養(yǎng)細胞的數(shù)量基本一致,細胞生長狀態(tài)良好。建議采用6孔板培養(yǎng)細胞,并保證細胞數(shù)量達到106左右,即細胞密度達70%-80%左右,即可收集培養(yǎng)液,于2-8℃、1000×g離心20分鐘,除去雜質及細胞碎片,取上清檢測。
細胞裂解液
貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g離心5分鐘后收集細胞;懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每106個細胞中加入150-200μL PBS重懸(推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑;若含量很低,可減少PBS的體積),并通過反復凍融或超聲,使細胞破碎。將提取液于2-8℃、1500×g離心10分鐘,取上清檢測。
■ 反復凍融:-80℃放置1h/液氮放置0.5h,然后置于30℃水浴鍋中,輕微振蕩,使其迅速融化,此操作反復2-3次即可。
■ 超聲方法:用超聲波發(fā)生器,以振幅14μm超聲處理30 s,在冰水浴條件下,破碎細胞;或者使用超聲波破碎儀,200 W,2 s/次,間隙3 s,總時間5 min。
樣本中建議提前加入蛋白酶抑制劑,常規(guī)推薦PMSF:工作濃度:17~174μg/mL(0.1~1mM)。
細胞培養(yǎng)過程中,有許多條件需要摸索,包括細胞類型、培養(yǎng)基組分、細胞數(shù)量、生產狀態(tài)、干預條件和物質等。前期基礎打得牢固,對后續(xù)ELISA或其他種類實驗的開展,及結果的分析,具有更多的參考意義。
ELISA實驗中細胞樣本的收集和處理方法
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